【用途】用于鸡传染性支气管炎病毒核酸的检测。

【规格】50T/盒

【试剂】

【操作步骤】

1.核酸提取  

(1) 取疑似病料（气管及分泌物、肾脏、肺脏等病毒靶组织），用PBS研磨成1：3悬液，在-20℃冻融1次，经12000 r/min离心3 min，上清液-20 ℃保存备用。

（2）取200uL上清液，移入1.5mL灭菌EP管中，加入200uLSR-I，漩涡振荡混合均匀，静置5min。

（3）加75uL TU-1，漩涡振荡混合均匀，12000r/min离心5 min。

（4）将上清转移到新的2 ml离心管（试剂盒内提供）中，加入300 uL SR-Ⅳ，上下倒置6-8次，混合均匀。

（5）将步骤4中的混合液移入制备管中（试剂盒内提供），并将制备管置于同一2 ml离心管，8000 r/min离心1min。

（6）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加500 uL SR-II，室温静置1min，12000 r/min离心1 min。

（7）弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，加700 uL SR-Ⅲ，12000 r/min离心1 min。

（8）将制备管置回到2 ml离心管中，12000 r/min离心2min。

（9） 将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中（试剂盒内提供），在制备管膜中央加40 uL TU-2， 室温静置1 min。12000 r/min离心1 min洗脱。洗脱液即为模板，即用或-20℃冻存备用。

2.One-Step RT- PCR加样体系(20uL体系)

3.反应程序

4.电泳

配制1.0%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL，混合1uL6xDNA Loading buffer，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加5uL DL2000 DNA Marker，在120-150v 电压下，1×TAE液中电泳15-20min，在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】

在约490bp左右位置出现扩增带，表明鸡传染性支气管炎病毒核酸检测阳性；

若在490bp处没有条带出现则样品判为阴性。                            

【注意事项】

1. 阳性对照极易污染试验环境，如果做阳性对照,吸取阳性对照枪头妥善处理

2. -20℃保存的试剂在使用前应完全融化，振荡混匀后 8000rpm 离心 15 秒使液体全部沉于管底，置冰盒中取用。严禁使用超过有效期限的试剂；严禁混用不同试剂盒组分。

3. PCR 实验室应按功能分为配液区、样品处理区、扩增区、电泳区。物流方向依次为配液区 →样品处理区→扩增区→电泳区。所有接触病料的物品、器具，尤其是阳性对照及PCR 产物和使用后的电泳缓冲液均应合理处置，以免污染实验室。

4. 严格按照国标和说明书要求操作。吸取液体时移液器吸头尽量在液体上层吸取，移液精确；吸取不同液体时必须更换移液器滴头，防止试剂组分污染以及样品污染。

5.试剂盒组分在生产分装时考虑到液体的损耗，实际装量略多于标注装量，因此严禁直接在 原包装中配制反应体系，以免造成反应体系各组分比例不准确。

【保存期】本制品有效期为1年。

【联系人】武经理        电话：18266598399

仅供兽医诊断使用